小鼠白細(xì)胞介素10試劑盒的操作方法

白介素10是一種多細(xì)胞源、多功能的細(xì)胞因子 ，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化，參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是目前炎癥與免疫抑制因子。在腫瘤、感染、造血系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用 ，與血液、消化、尤其是心血管系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。

在1989年，Mosmannand及他們的同事描述了一種新的免疫介質(zhì)，由Th2細(xì)胞克隆分泌，能夠抑制Th1細(xì)胞克隆IL-2和IFNr的合成。早期被命名為細(xì)胞因子合成抑制因子(CSIF)，這種因子后來被命名為IL-10，在這被發(fā)現(xiàn)的21年期間，很多研究深入剖析了這個(gè)細(xì)胞因子的生物學(xué)特性。

細(xì)胞的來源：

目前已知并非只有特定的T細(xì)胞亞群才能合成IL-10，幾乎所有淋巴細(xì)胞均能合成IL-10。體內(nèi)最重要的來源主要是單核巨噬細(xì)胞和T輔助細(xì)胞，此外，樹突狀細(xì)胞，B細(xì)胞，細(xì)胞毒性T細(xì)胞，γδT細(xì)胞，NK細(xì)胞，肥大細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞也能合成IL-10，這些細(xì)胞分泌IL-10主要決定于特定的刺激，受損組織類型和某種免疫反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)。
單核巨噬細(xì)胞在各種內(nèi)源性和外源性介質(zhì)的作用下激活后分泌IL-10，如LPS(通過激活TLR4,TRAF3,NF-κBp65/p50,和ERK激酶)、兒茶酚胺(通過激活蛋白激酶A和CREB-1/ATF-1)引起IL-10基因轉(zhuǎn)錄。單核巨噬細(xì)胞在清除凋亡細(xì)胞過程中也會分泌IL-10，這一過程依賴于CD36和p38絲裂原激活蛋白(MAP)激酶，除了轉(zhuǎn)錄水平，等最近認(rèn)為IL-10也被microRNA在轉(zhuǎn)錄后期所調(diào)節(jié)。

操作步驟：

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀
釋。
1000pg/ml 5 號標(biāo)準(zhǔn)品150μl 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
500pg/ml 4 號標(biāo)準(zhǔn)品150μl 的5 號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
250pg/ml 3 號標(biāo)準(zhǔn)品150μl 的4 號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
125pg/ml 2 號標(biāo)準(zhǔn)品150μl 的3 號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
62.5pg/ml 1 號標(biāo)準(zhǔn)品150μl 的2 號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待
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3
測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl， 然
后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不
觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此
重復(fù)5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應(yīng)在加終止液
后15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。